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Everlab云端实验室实验方法:火箭免疫大发体育电

  1.5g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解(注意不要溢出且注意加入蒸发的水),然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀,置4℃保存备用。

  1. 玻璃板2. 模具3. 打孔器和挑针4. 滴管5. 有盖搪瓷盒(内铺有湿润的滤纸)6. 温箱(25℃)7. 三角烧杯8. 玻璃搅拌9. 微量加样器10. 其他常用器材

  以分别固定抗原含量与抗体浓度的方法,选取最小抗原量与最低抗体浓度,在免疫电泳后能出现最清晰项端狭窄且尖的锥形沉淀峰,长达2~5cm者为标准。一般抗原用量为0.5~5微克,抗血清用量为5~10微升,稀释度于1:10~1:200之间进行选择。

  将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将表面覆盖即可,放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。

  根据上述选择结果,取一定量抗血清与一定量融化并冷却至56℃的1.5%巴比妥缓冲琼脂混合,大发体育使抗血清的浓度为以上述方法选择出的最适浓度,浇制抗血清琼脂板。琼脂厚度为1~2mm,玻板大小可根据实验所需而确定。如用5×7.5cm大小玻板时,约需抗血清琼脂6ml.

  待琼脂凝固后,于距玻板一长边10mm处,大发体育以3mm孔径打孔器打孔一排,孔距5mm.于各孔中加入抗原液,每孔10微升。每次实验中应加入几个不同浓度的标准抗原以作对照。稀释范围包括标本含量的最高与最低水平。

  将琼脂板置于电泳槽横梁上,加样端位于负极,以双层滤纸联接琼脂板与电泳槽内缓冲液(槽内缓冲液为0.06M pH8.6巴比妥缓冲液)。接通电源,板端电压3v/cm,电流强度3mA/cm,电泳5小时。

  电泳毕,取出琼脂板,依次用生理盐水、蒸馏水浸泡后,大发体育加1%鞣酸冲洗琼脂板,晾干,即可观察与测定结果。也可以常规蛋白质染色法染色后观测结果。测定结果的方法有两种:一是测量沉淀峰的高度(自孔中央至峰尖),以mm计;另一是以求积仪测量沉淀峰的面积,以mm2计。前者较简便,后者较准确。根据测定的结果,大发体育从标准曲线中计算出待检标本中的抗原含量。大发体育

  用上述选择好的最适浓度抗血清制备琼脂板。打孔,加入合适比例的5~10个标准抗原浓度,反复试验10次,取每次电泳后所测定的沉淀峰高度(或面积)的平均值,绘出标准曲线。

  影响单向定量免电泳的因素很多,主要是要选择好抗体浓度,使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量,如效价高,则免疫血清琼脂的比例为1:5-9,如效价低,则免疫血清与琼脂的比例为2:5。

  加入的抗体量要合适,大发体育以保证抗原、抗体的合适比例,以便形成清晰的沉淀峰。抗体的准确用量应通过预实验来决定,即:加入不同量的抗血清,用一定量的抗原进行火箭电泳,选出沉淀峰在2-5cm之间的相应抗体浓度就是合适的抗体用量。

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