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大发在线体育【免疫疾病研究】PIK3CD基因突变致

  原标题:【免疫疾病研究】PIK3CD基因突变致PI3Kδ过度活化综合征临床及免疫学特点分析

  作者:唐文静* 王薇 罗颖 王艳平 李黎 安云飞 苟丽娟 马明圣 何庭艳 杨军 赵晓东 宋红梅

  探讨中国PIK3CD基因增功能突变所致PI3Kδ过度活化综合征(APDS)的临床表现、免疫学表型、治疗及预后情况。

  回顾性分析重庆医科大学附属儿童医院、北京协和医院、深圳儿童医院2014年6月至2016年11月收治的15例APDS患儿的病例资料,实验室检查、治疗效果及预后等情况。

  (1)15例患儿中男11例,女4例,中位发病年龄1岁,中位诊断年龄4岁4月龄。均为PIK3CD基因E1021K位点杂合突变。(2)临床始发表现:以反复呼吸道感染为主,肺炎12例,支气管扩张5例。其他主要表现包括反复、慢性腹泻11例,EB病毒和(或)巨细胞病毒感染10例,肝脏及脾脏肿大13例,慢性淋巴结病10例。(3)免疫学检查:IgM水平升高(11例)、IgG缺乏(6例);CD4+T淋巴细胞减少(7例),尤其是初始CD4+T细胞减少(9例);终末分化的效应记忆CD8+T细胞增加(5例);B细胞减少(11例),其中初始B细胞减少(9例),而过渡B细胞增加(5例)。(4)经1~29个月随访,15例患儿现存活13例,其中5例接受规律静脉注射免疫球蛋白治疗,感染频率降低;3例接受雷帕霉素靶向治疗,肝脾肿大明显好转。

  APDS发病年龄早,以反复呼吸道感染、肝脾淋巴结肿大、巨细胞病毒或EB病毒血症为主要临床表现,部分患儿有自身免疫现象及淋巴瘤。免疫表型为初始CD4+T细胞及初始B细胞减少,过渡B细胞及终末分化的效应记忆CD8+T细胞增加,IgM水平升高。E1021K杂合突变为热点突变。规律的静脉注射免疫球蛋白治疗可减少该类原发性免疫缺陷病患儿感染,雷帕霉素靶向治疗可改善肝脾肿大。

  PI3Kδ过度活化综合征(activated phosphoinositide 3-kinase δ syndrome,APDS)为常染色体显性遗传免疫缺陷病,由PIK3CD基因生殖细胞水平增殖功能突变所致。该病最初于2013年由Angulo等[]发现,迄今为止,全球报道病例不足百例[,,,,],而中国尚无相关病例的大宗报道。为此,对重庆医科大学附属儿童医院、北京协和医院、深圳市儿童医院2014年6月至2016年11月确诊的15例APDS患儿进行回顾性分析,探讨其临床表现、免疫学表型、基因型、静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)等治疗效果及预后情况,旨在为早期诊断、判断病情及APDS精准治疗提供更为可靠的临床依据。

  纳入患儿符合反复呼吸道感染、肝脾淋巴结肿大、巨细胞病毒或EB病毒血症的临床表现,同时采用二代测序及Sanger测序确诊为PIK3CD基因突变,均为E1021K位点杂合突变。病例诊断中部分涉及研究的内容已获重庆医科大学附属儿童医院(001/2013)、北京协和医院(2013-07-26函)及深圳市儿童医院(2013-07-24函)伦理委员会批准,患儿监护人已签署知情同意书。

  收集APDS患儿的发病年龄、性别、诊断年龄、初发症状、临床表现、免疫学初筛结果、IVIG治疗、雷帕霉素治疗及预后情况。

  采用参考文献[]所示方法,取全血标本500 μl,应用双平台法(流式细胞仪和血细胞计数仪)检测人外周血淋巴细胞亚群绝对数及相对数,分析辅助T细胞、细胞毒性T细胞和B细胞的12个精细免疫分型。提取外周血DNA后,采用实时定量PCR对患儿T细胞受体删除环(TRECs)水平进行检测,以反映其胸腺近期T细胞输出水平[]。提取外周血RNA,反转录合成cDNA后,采用免疫谱型扫描技术分析T细胞受体多样性[]。密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC),采用CFSE染料稀释法检测T细胞增殖情况。

  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理;其中计量资料TRECs用±s表示,TCRVβ亚家族平均复杂分数用均数和范围表示,患儿发病年龄及诊断年龄用中位数和范围表示;计数资料用例表示;组间比较采用非配对t检验,P0.05为差异有统计学意义。

  15例患儿中男11例,女4例;中位发病年龄1岁(3月龄~4岁),中位诊断年龄4岁4月龄(0~12岁),其中例9因阳性家族史出生时即获确诊。本组来自12个无亲缘关系的中国家系,覆盖广西、江苏、山西、四川等9个省、市,其中在2个家族(家族B,患儿为例2、例3;家族F,患儿为例7~9)有聚集发病现象。

  15例中10例以呼吸道感染为首发表现,2例以淋巴结肿大为首发表现,1例以腹泻起病,另2例分别以贫血、脾大为首发表现。

  本组中13例有反复呼吸道感染表现,其中肺炎12例;支气管扩张5例,其中1例胸部影像学提示马赛克灌注征象(例7,大发在线体育)。5例支气管扩张患儿有杵状指表现,纤维支气管镜检查提示患儿支气管扩张、慢性气管支气管内膜炎症,且呼吸道表面可见诸多结节增生。11例患儿有反复、慢性腹泻表现,其中8例腹泻者有间断脓血便,4例患儿电子结肠镜检查提示多发性结直肠息肉,其中1例病理活检结果提示黏膜固有层大量单核细胞及淋巴细胞浸润,大发在线体育淋巴滤泡增生(例5,);2例患儿结肠镜检查提示炎症性肠病,粪便培养并未见隐孢子虫等病原。EB病毒和(或)巨细胞病毒(CMV)感染见于10例患儿,其他常见感染病原为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌,金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、铜绿假单胞菌、呼吸道合胞病毒、大肠埃希菌等亦有检测到,其中例7患儿有明确结核分枝杆菌感染,进行抗结核治疗,例2及例3患有顽固性寻常疣。

  图1PI3Kδ过度活化综合征患儿(例7)胸、腹部CT图A:提示支气管扩张(圆圈区域所示),肺实变(水平箭头所示),马赛克灌注征象(垂直箭头所示);B:腔静脉后淋巴结肿大(圆圈区域所示)

  图2PI3Kδ过度活化综合征患儿(例5)结肠活检病理图 提示黏膜固有层大量单核细胞及淋巴细胞浸润,结肠淋巴滤泡增生(HE×200)

  图3PI3Kδ过度活化综合征患儿(例4)肝脏活检病理图 提示肝窦及门静脉区淋巴细胞及中性粒细胞浸润(HE×200)

  慢性淋巴结病10例,肝脏及脾脏肿大13例。8例患儿胸部及腹部影像学检查提示肺门、纵隔、腔静脉后及腹膜后多发性淋巴结肿大(例7,),4例患儿接受颈部淋巴结活检,提示反应性增生、慢性化脓性淋巴结炎。1例患儿接受肝脏活检,病理结果提示肝窦、门静脉区淋巴细胞及中性粒细胞浸润(例4,)。淋巴结肿大患儿中有8例具有反复EBV,CMV病毒血症。

  有自身免疫现象者7例,包括自身免疫性溶血性贫血,抗ssDNA抗体、抗ANA抗体等自身抗体阳性。血液系统异常表现11例,包括贫血、血小板减少、中性粒细胞减少,其中4例(例3、7、12、14)直接抗人球蛋白试验结果为阳性。例11自1岁余起开始出现膝关节、踝关节及髋关节肿痛,相关自身抗体检测结果为阴性。例10患儿2岁时确诊为哮喘。5例患儿(例1、2、4、7、13)生长发育水平明显落后,就诊时身高、体重均小于同年龄同性别儿童生长曲线百分位值。临床表现见。

  免疫球蛋白(Ig)水平具有多变性,6例患儿IgG减少;8例患儿总IgG正常,其中3例进行了IgG亚类检测,2例IgG2显著降低。IgM升高(11例)或正常(4例)为常见表现,10例患儿IgA水平正常。

  淋巴细胞免疫分型具体结果分析见。典型的发现为CD4+T细胞减少,尤其是初始CD4+T细胞减少,而CD8+终末分化的效应记忆T细胞增加;B细胞尤其是初始B细胞减少,5例患儿记忆B细胞减少,而过渡B细胞增加。

  采用实时定量PCR方法对10例患儿(例1~10)进行了TRECs水平检测,均较同龄正常值明显降低(21±7比346±35,P0.01),提示患儿胸腺近期可能无输出或输出极低;新生儿期患儿(例9)TRECs水平与正常对照并无明显差异。采用免疫谱型扫描技术,分析7例患儿(例1~3,例6~9)TCR多样性,结果显示非新生儿期患儿的T淋巴细胞受体β链V区TCRVβ呈寡克隆或单克隆分布,患儿组平均复杂分数[4.459(1.093~6.887)]低于正常值[5.290(2.803~6.764)],提示T细胞受体多样性受限;而例9的TCRVβ多样性无明显受损。对6例(例1~3,例6~8)进行了T细胞增殖功能检测,其结果具有多变性,其中3例患儿CD4+T细胞及CD8+T细胞增殖水平正常;1例患儿CD8+T细胞增殖功能受损,2例患儿CD4+T细胞及CD8+T细胞增殖功能均受损。

  15例患儿均进行了家系分析;通过二代测序,以及对患儿外周血、毛发、颊黏膜中提取的DNA进行PCR扩增、一代测序验证,最终确定15例患儿均为E1021K位点生殖细胞水平新生杂合突变,父母均非致病基因携带者。其中两个家系为聚集发病,考虑可能父亲或母亲生殖细胞水平发生突变,征得家族F父亲同意后采集其精液提取精子细胞DNA进行PCR扩增、TA克隆及测序分析结果均为野生型,无突变序列()。

  图4PI3Kδ过度活化综合征家族F中例7、例8患儿及其父母PIK3CD基因测序序列图 A~D:分别示例7(左)和例8(右)外周血cDNA、外周血DNA、颊黏膜DNA及头发DNA进行PIK3CD基因测序结果图,第24号外显子存在c. 3061GA杂合突变(箭头),且突变频率一致,提示为生殖细胞水平突变;E:两例患儿父亲(左)及母亲(右)外周血DNA测序示相同位点无突变,提示患儿突变为新生突变;F:从两例患儿父亲精子细胞中提取DNA,进行TA克隆,挑选75个克隆子进行测序,发现相同位点(方框)无突变

  经1~29个月随访,15例患儿现存活13例,其中2例(例8、9)准备接受同胞姐姐骨髓造血干细胞移植(HSCT),5例接受规律IVIG输注,规律IVIG输注患儿其呼吸道感染频率及严重程度较未接受输注者明显降低;5例患儿因经济因素或其他原因未遵医嘱规律治疗,3例(例1、6、14)同时接受雷帕霉素治疗,观察时间分别为1年、半年、半年,其淋巴结、肝脾肿大表现有明显好转。2例患儿(例5、7)均因严重感染、脓毒性休克死亡。

  APDS为常染色体显性遗传的原发性免疫缺陷病,目前尚无相关发病率报道,对该病外显率的研究也属空白;但从该病发现时间及报道病例数来看,该病的实际发病率并不低,在联合免疫缺陷病中可能属于高者。据国外关于APDS临床及免疫表型的大宗报道显示,该病表型具有可变性,病情轻者可至成人期尚无相关症状,重者在儿童期即表现出致死性严重免疫缺陷[]。由于该病临床表现变异较大,首诊时根据其临床及免疫学特点可能诊断为高IgM综合征、X连锁淋巴组织增生综合征、常见变异型免疫缺陷病、CTLA-4基因突变、LRBA基因突变等。有趣的是,在2014年相继有学者报道PIK3R1基因突变亦可导致PI3Kδ过度活化,引起与APDS类似的临床综合征,并将其命名为APDS2[]。APDS2为常染色体隐性遗传,PIK3R1突变将导致调节亚基p85α表达缺失,从而引起PI3K-Akt-mTOR信号通路过度活化。此外,近期有研究报道PTEN,PI3K信号通路中的一个抑制分子,其失功能突变在某些患儿可导致类似APDS临床及免疫表型的免疫缺陷[]。这些发现提示PI3K信号通路对于免疫应答的稳态维持具有重要作用,在与APDS具有相似表现的基因未确诊患儿中,应筛查其他可导致PI3K信号通路过度活化的相关基因。

  我们总结了迄今为止国内最大宗APDS患儿的临床及免疫学特征,结果与国外报道类似。反复呼吸道感染见于绝大部分APDS患儿。值得注意的是,5例发生支气管扩张的患儿中有4例其总IgG水平正常,提示这些患儿支气管扩张发生很早,对于轻微的免疫球蛋白异常亦可筛查出APDS。最近研究表明,PI3Kδ在肺部纤维母细胞,TNF-α刺激的内皮或滑膜细胞上亦有表达;p110δ可调节上皮细胞极性,对于呼吸道上皮细胞功能具有重要作用[]。有学者推测在炎症过程中p110δ表达可能通过局部产生TNF-α从而损伤黏膜屏障功能,加重局部炎症反应[]。因此,APDS患儿的肺部表现可能是p110δ免疫功能及p110δ在内皮细胞的固有功能两者之间的相互作用所导致。超过一半的患儿有EBV及CMV感染,大发在线体育国外大宗病例报道显示,疱疹病毒感染与Th细胞、细胞毒性T细胞及NK细胞数量减少并不具有相关性,而弥漫性淋巴结病与全身性疱疹病毒感染具有相关性[]。非肿瘤性淋巴组织增生、肝脾肿大为该病常见表现,其原因尚不完全清楚,但多数APDS患儿外周血淋巴细胞减少,且在呼吸道及胃肠道黏膜表面发现较多T细胞及B细胞阳性的淋巴结节样增生;提示PI3K信号通路活化在淋巴细胞迁移中可能具有重要作用[]。同时,部分APDS患儿具有炎症性或自身免疫表现。PI3Kδ活性增强在自身免疫性疾病,如SLE患者中亦有报道[]。因此,抑制PI3Kδ活性可能对这些自身免疫性疾病亦具有治疗作用。PIK3CD基因体细胞水平增功能突变与淋巴样恶性肿瘤相关。尚未发现本组有恶性肿瘤表现者,但国外报道的53例患者中发现7例有淋巴瘤[],这可能与我们的患儿年龄较小有关,尚需继续观察。

  APDS患者感染病原包括细菌、病毒,少部分亦有真菌感染,而免疫表型分析则进一步证实了其为联合免疫缺陷。大发在线体育典型的T细胞表型为Th细胞及胸腺近期输出细胞减少,大发在线体育细胞毒性T细胞主要为效应或活化表型。而对不同年龄阶段患儿的TRECs水平分析表明,在生命早期其TRECs水平可能接近正常,而随年龄增长逐渐减少,提示PI3K对于胸腺T细胞发育及输出的影响可能具有时间累积效应。对TCRVβ分析表明,在生命早期其TCRVβ多样性接近正常,而随年龄增长则明显受限,这可能与胸腺输出T细胞明显减少及慢性感染所致抗原特异性T细胞克隆增加有关,活化诱导的细胞死亡在此过程中可能亦有一定作用。在B细胞方面,本组患儿就诊时多数已出现B细胞减少,尤其是类别转换的记忆B细胞数量减少,而过渡B细胞增加,提示PI3K信号通路在B细胞成熟及凋亡等过程中具有重要作用[]。本组73%的患儿IgM水平升高,提示PI3K信号通路过度活化可能与免疫球蛋白类别转重组缺陷有关。

  此外,本研究发现的一个有趣现象是APDS患儿具有家族聚集倾向,而患儿父母均非致病基因携带者。我们对其中一个家庭中父亲的精子细胞提取DNA进行了基因分析,但并未发现PIK3CD基因突变。此种现象在其他常染色体显性遗传的原发性免疫缺陷病如先天性中性粒细胞减少病例中亦有报道[],目前考虑生殖细胞配子水平配子体嵌合是最可能原因,但患儿均发生新生突变亦有可能。

  在本研究及国外报道的患者中,早期开始规律IVIG有助于减少感染几率、减轻感染严重程度,但IVIG似乎并不能改善患者生长发育延迟的表现。国外关于APDS病例的大宗报道中有5例患者接受了HSCT,随访中位年限4.2年(1.0~14.0年),其中3例移植成功,成功解决了感染及淋巴增生问题,1例嵌合率极低,导致移植后需长时间IVIG治疗,1例在HSCT前接受了脾脏切除,在移植后2年因败血症死亡[]。本组2例患儿拟行HSCT。关于免疫抑制治疗方面,国外报道中13%的患者至少接受了1个疗程的针对淋巴增生、自身免疫或炎症性疾病的免疫抑制治疗;利妥昔单抗对于8例患者的自身免疫性溶血性贫血及5例患者的非肿瘤性淋巴组织增生有效,但同时导致这些患者B细胞减少;6例接受雷帕霉素治疗,5例淋巴组织增生表现明显减轻[]。本组3例接受雷帕霉素治疗,肿大肝脾明显缩减。然而,直接抑制PI3Kδ活性对于APDS患者可能是更好的治疗方式。针对某些癌症及自身炎症性疾病的选择性PI3Kδ抑制剂目前尚在临床试验中。这种特异性治疗对于APDS患者的感染及非感染并发症都具有重要作用。

  总之,APDS是一种具有多变表型的联合免疫缺陷病,其常见表现包括反复细菌或病毒所致反复呼吸道感染、支气管扩张、淋巴结节样增生、自身免疫等。且PI3K-Akt-mTOR信号通路上其他分子突变导致该通路过度活化可能亦可引起类似表现。该类PID对于雷帕霉素及特异性分子抑制剂的治疗可能具有良好反应,刷新了我们对PID治疗的观点,即除HSCT、基因治疗外,针对靶向分子的治疗可能成为某些类型PID的主要治疗方式之一,且对于其他与该信号通路相关的自身免疫性或自身炎症性疾病的治疗亦具有重要价值。

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